重庆市自然科学基金(2011BA5037)
- 作品数：33 被引量：53H指数：4
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- 相关机构：重庆医科大学重庆医科大学附属永川医院重庆医科大学附属第一医院更多>>
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- 拉帕替尼抑制HL60细胞增殖和促进细胞凋亡的机制被引量：2
- 2017年
- 目的探讨拉帕替尼对急性髓细胞白血病HL60细胞增殖和凋亡的影响及其相关分子机制。方法用(5、10、15)μmol/L的拉帕替尼处理HL60细胞24 h,光学显微镜下观察细胞形态变化,CCK-8法检测细胞活力,集落形成实验检测细胞增殖能力,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记法结合流式细胞术检测细胞凋亡,Wright改良染色(LIU染色)和Hoechst33342荧光染色观察细胞核形态;Western blot法检测Bax、Bcl2、胱天蛋白酶3(caspase-3)、caspase-9、裂解型caspase-3(c-caspase-3)、裂解型caspase-9(c-caspase-9)、裂解型多腺苷二磷酸核糖聚合酶(c-PARP)、蛋白磷酸酶2A细胞增殖调节抑制因子(CIP2A)、c-MYC、AKT和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白水平。结果与对照组相比,拉帕替尼能以剂量依赖的方式抑制HL60细胞的增殖,促进细胞凋亡,诱导细胞产生核碎裂、染色质凝聚。下调Bcl2蛋白的表达,上调Bax、c-caspase-3、c-caspase-9和c-PARP蛋白水平,下调CIP2A、p-AKT和c-MYC蛋白水平。结论拉帕替尼能够抑制HL60细胞增殖并促进细胞凋亡,这一作用可能与下调CIP2A/AKT/c-MYC信号通路有关。
- 刘路刘北忠赵毅陈敏姚仕菲李连文肖春兰单志灵徐婷淦柳根钟梁
- 关键词：拉帕替尼HL60细胞细胞增殖细胞凋亡
- Ad-NLS-RARα对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制被引量：1
- 2013年
- 目的将已构建验证成功的重组腺病毒Ad—NL＆RARα感染至HL-60细胞中，探讨其对HL-60细胞增殖及全反式维甲酸（ATRA）诱导的HL-60细胞分化的影响及机制。方法将验证正确的腺病毒经Protaminesulfate辅助感染Hl-60细胞，检测感染效率，用RT-PCR和Westernblot检测目的基因在HL-60细胞中的表达情况。MTT法检测细胞增殖情况。病毒感染HL-60细胞24h后，用2．5μmol／LATRA处理，流式细胞术（FCM）检测细胞表面分化抗原CDllb的表达。RT—PCR和Western blot检测GMYC基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果在Protamine sulfate辅助感染作用下，重组腺病毒Ad—NLS-RARα和阴性对照腺病毒Ad—KZ对HL-60细胞的感染效率可达70％～80％。NL＆RARα基因的RT—PCR和Westernblot结果显示，感染了重组腺病毒Ad—NL＆RAR口的HL-60细胞的NLS-RAR口基因的mRNA及蛋白表达水平明显增高（P〈0．05）。MTT法检测表明感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的细胞增殖能力增高（P〈O．05）。FCM检测结果显示，经ATRA处理后，感染Ad—NLS-RAR口重组腺病毒的HL-60细胞，CDllb表达较阴性对照组和未感染组下调（P〈O．05）。C-MYC基因的RT—PCR和Westernblot检测结果表明，经ATRA处理后，感染Ad—NLS-RARα重组腺病毒的细胞C—MYC基因的mRNA和蛋白水平均高于其他两组（P〈0．05）。结论重组腺病毒Ad—NL-SRARα可以促进HL-60细胞的增殖，并通过上调GMYC基因的表达，抑制ATRA诱导的HL-60细胞分化。
- 胡秀秀刘北忠钟梁高远梅张曦吴秀娟王慧朱新瑜
- 关键词：重组腺病毒HL-60细胞细胞分化
- 重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定
- 2013年
- 目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。
- 高远梅刘北忠张曦胡秀秀钟梁
- 关键词：重组腺病毒K562细胞细胞增殖
- 重组慢病毒LV5-NE的构建及NE促进NB4细胞增殖被引量：1
- 2016年
- 目的构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础。方法以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。用Western blot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测p Akt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达。结果成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P<0.05)结论 NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节。
- 杨蓉钟梁刘北忠阳小群蒋开玲李浏宋浩
- 关键词：中性粒细胞弹性蛋白酶增殖NB4细胞
- NLS-RARα通过激活AKT调节白血病NB4细胞的增殖被引量：1
- 2016年
- 目的构建携带NLS-RARα的重组慢病毒,感染白血病NB4细胞并观察其对NB4细胞增殖和AKT蛋白的影响。方法以质粒p CMV-HA-NLS-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,将其亚克隆到慢病毒表达载体质粒LV5中,经DNA测序鉴定重组载体,用4质粒系统共转染293T细胞,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组慢病毒的滴度;重组慢病毒感染NB4细胞,经过嘌呤霉素筛选获得稳定转染NLS-RARα的NB4细胞株;CCK-8法检测NLSRARα对NB4细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期和感染效率;Western blot分别检测NLS-RARα、t-AKT和p-AKT的表达。结果 NLS-RARα克隆入LV5的多克隆位点,慢病毒浓缩后滴度为2×108Tu/m L;感染效率为86.54%;NLS-RARα能够明显促进细胞增殖,S期细胞增多,G1和G2期细胞减少;NLS-RARα基因在NB4细胞中稳定的表达,同时p-AKT明显增高,用PI3K抑制剂LY294002处理后p-AKT明显降低。结论 NLS-RARα通过激活AKT促进白血病NB4细胞的增殖。
- 宋浩李浏钟梁蒋开玲阳小群杨蓉刘北忠
- 关键词：急性早幼粒细胞白血病增殖AKT
- PKM2在白血病NB4细胞系的分布及对c-Myc蛋白的影响
- 2017年
- 探讨PKM2在白血病NB4细胞中的分布情况及对c-Myc蛋白的影响。免疫荧光技术检测PKM2在NB4细胞中的分布情况。将含靶点序列的GV248载体、包装质粒Helper 1.0和Helper 2.0共转染293T细胞,包装慢病毒。收集病毒上清,浓缩纯化后感染NB4细胞,荧光显微镜观察感染效率,Western blotting检测PKM2和c-Myc蛋白的表达变化。CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果显示,PKM2在NB4细胞核及细胞质中均有表达,细胞核中比例较大。成功构建LV-PKM2-RNAi病毒,感染的细胞PKM2和c-Myc表达下调(p<0.05),细胞增殖能力降低(p<0.05)。这些结果表明PKM2主要分布在NB4细胞核,抑制PKM2表达可明显抑制NB4细胞增殖,并抑制c-Myc蛋白表达。
- 单志灵刘北忠淦柳根肖春兰徐婷杨蓉宋浩李浏钟梁
- 关键词：NB4细胞
- 中性粒细胞弹性蛋白酶的过表达促进K562细胞增殖并抑制其凋亡被引量：3
- 2015年
- 目的利用Ad Easy系统构建携带人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)基因的重组腺病毒表达质粒,并感染K562细胞,观察其对K562细胞增殖和凋亡的影响。方法以急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株HL-60的RNA为模板,经反转录PCR得到NE基因的编码区并克隆入穿梭载体p Ad Track-CMV,得到p Ad-NE,经HindⅢ、EcoRⅤ酶切鉴定和测序正确后,将其转化入p Ad Easy-1-BJ5183进行同源重组,得到重组子Ad-NE,经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞进行包装。14 d之后收获原代病毒,经5轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。感染K562细胞后,荧光显微镜初步观察感染效率,同时用流式细胞术检测感染效率;Western blot法进一步鉴定NE是否表达上调;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期变化。结果酶切鉴定及测序结果表明重组穿梭质粒p Ad-NE构建成功;酶切鉴定显示同源重组成功,得到重组子Ad-NE;荧光显微镜表明病毒包装成功;经过5轮扩增后,病毒滴度达到1.64×1012pfu/m L;感染K562细胞后,荧光显微镜观察感染效率达80%左右;Western blot法检测到NE表达上调;CCK-8实验显示NE表达上调后K562细胞增殖能力增强;流式细胞术显示S期细胞明显增多并且细胞凋亡减少。结论过表达NE可促进K562细胞增殖并抑制其凋亡。
- 蒋开玲马鹏鹏阳小群钟梁王慧朱新瑜刘北忠
- 关键词：中性粒细胞弹性蛋白酶重组腺病毒增殖凋亡K562细胞
- JTV1对K562细胞增殖和凋亡的影响及其机制被引量：4
- 2011年
- 目的观察上调JTV1基因的表达对人白血病K562细胞系增殖与凋亡的影响并探讨其机制。方法将携带有JTV1基因的pcDNA3.1-JTV1载体转染人K562细胞作为阳性转染组,转染pcDNA3.1空载体作为空载体转染组,未转染的K562细胞为未转染组。通过集落形成实验检测各组K562细胞的增殖能力,采用流式细胞术与Annexin-PI双染色结合分析细胞周期和细胞凋亡率,同时采用RT-PCR法检测JTV1基因及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、C-myc mRNA水平的变化,采用Western blotting检测基因JTV1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、C-myc蛋白水平的变化。结果集落形成实验结果显示上调JTV1基因表达后K562细胞的增殖能力明显降低。流式细胞术与Annexin-PI双染色检测结果显示,与空载体转染组及未转染组相比,阳性转染组K562细胞的G期细胞比例明显升高(P<0.05);阳性转染组中Bax基因的mRNA水平和蛋白水平较空载体转染组及未转染组均明显上升,而Bcl-2基因和C-myc基因的mRNA水平和蛋白水平则明显下调(P<0.05)。结论 JTV1基因过表达可能通过抑制基因Bcl-2和C-myc的表达增强基因Bax的表达,从而抑制K562细胞系的增殖并促进其凋亡。
- 吴燕刘北忠王翀钟梁朱丹王春光金丹婷高艳军黎亮
- 关键词：基因基因BCL-2基因C-MYC基因BAXK562细胞
- 干扰GINS2表达对HL60细胞增殖和凋亡的影响被引量：6
- 2013年
- 目的:探讨靶向抑制GINS2基因表达后对人早幼粒细胞白血病细胞株HL60增殖和凋亡的影响及其机制。方法:RT-PCR分别检测GINS2基因在三株白血病细胞HL60、U937、THP-1的表达。设计与合成针对GINS2基因的干扰序列,稳定转染高表达该基因的HL60细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况;RT-PCR和Western blot分别检测各组细胞转染后mRNA和蛋白质水平;MTT法检细胞的增殖和凋亡情况;流式细胞术分析细胞的凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果:在三株白血病细胞株中,GINS2的表达量由低到高依次是:THP-1,U937,HL60。干扰质粒转染HL60细胞后,与阴性对照组及未处理组相比,干扰组GINS2的mRNA和蛋白质水平均显著降低,且细胞的增殖能力明显受抑。同时,凋亡相关蛋白Bax表达水平显著增高而Bcl2显著降低。结论:干扰GINS2基因表达后,其mRNA和蛋白质水平均显著降低,可通过上调Bax表达,下调Bcl2表达来抑制HL60细胞增殖并促进其凋亡。
- 张曦刘北忠高艳军黎亮高远梅胡秀秀马鹏鹏钟梁
- 关键词：细胞凋亡HL60细胞BAXBCL2
- 表没食子儿茶素没食子酸酯通过活化p38α诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞凋亡被引量：1
- 2016年
- 该文研究了表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)诱导NB4细胞凋亡的可能分子机制。不同浓度梯度EGCG处理NB4细胞,或预先用p38α抑制剂PD169316处理NB4细胞,再用EGCG处理。用CCK-8(cell counting kit-8)方法检测细胞增殖情况,用FITC-Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况,用Western blot检测p38α、P-p38α、Bcl-2和Bax蛋白质表达水平。结果显示,随着EGCG浓度的升高,NB4细胞增殖率逐渐降低,细胞凋亡率明显升高。P-p38α和Bax蛋白质表达水平升高,与EGCG浓度呈正相关;而Bcl-2蛋白质表达水平降低。p38α抑制剂处理后,NB4细胞增殖率升高,凋亡率降低,Bax蛋白质表达水平降低,而Bcl-2蛋白质表达水平无明显变化。以上结果表明,EGCG可能通过活化p38α诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞凋亡。
- 淦柳根刘北忠单志灵肖春兰徐婷宋浩李浏杨蓉钟梁
- 关键词：EGCGNB4细胞凋亡
