广西研究生教育创新计划(2009105981002M180)
- 作品数：2 被引量：5H指数：1
- 相关作者：王琪钟艳平李力黎丹戎林若芸更多>>
- 相关机构：广西医科大学广西医科大学附属肿瘤医院广西壮族自治区妇幼保健院更多>>
- 发文基金：广西研究生教育创新计划广西壮族自治区自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- hTERT重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的:构建携带人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的慢病毒表达载体及探索高滴度第三代慢病毒包装体系的建立,并观察hTERT基因在细胞中的表达调控。方法:将hTERT基因片段插入慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒表达质粒pCDH-hTERT。通过酶切、DNA测序验证hTERT片段的准确性后,将pCDH-hTERT、pCDH-PACK-GAG、pCDH-PACK-REV和VSV-G共转染包装细胞293T,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,并通过PCR及293T中hTERT蛋白的表达鉴定重组慢病毒。将重组慢病毒感染靶细胞,通过检测标记蛋白-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、hTERT蛋白表达和端粒酶活性进一步验证pCDH-hTERT在细胞中表达。结果:pCDH-hTERT携带正确hTERT基因,将其与包装质粒共转染293T细胞能产生重组病毒;病毒基因组PCR证实hTERT基因插入,感染293T后可检测到hTERT蛋白的表达;目的基因hTERT能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞并稳定表达,荧光显微镜下可直接观察GFP;RT-PCR、Western blot及TRAP-PCR-ELISA法检测感染后的细胞,发现hTERTmRNA、hTERT蛋白的表达及端粒酶活性明显增强。结论:成功构建了第三代慢病毒表达载体pCDH-hTERT,并获得高效的重组慢病毒,能将外源hTERT基因导入靶细胞重建端粒酶活性,为构建永生化细胞系奠定基础。
- 钟艳平林若芸黎丹戎胡晓霞王琪李力
- 关键词：人端粒酶逆转录酶慢病毒载体绿色荧光蛋白
- 过表达人端粒酶逆转录酶促进人脐静脉血管内皮细胞增殖被引量：4
- 2011年
- 人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的催化亚基,专司在染色体末端添加端粒重复序列,与维持端粒长度与功能有关.为探索hTERT的生物学功能,本研究以人脐静脉血管内皮细胞(hUVEC)为研究对象,观察了hTERT基因过表达对hUVEC细胞增殖作用和端粒酶活性的影响.利用构建的pEGFP-C1-hTERT融合基因表达载体转染hUVEC,结果显示,转染后的细胞可见GFP表达,提示转染细胞有GFP-hTERT融合蛋白表达.RT-PCR、免疫组化和TRAP-PCR-ELISA法显示,与未转染细胞比较,转染细胞的hTERT mRNA、蛋白质表达水平明显升高,端粒酶活性明显增强.MTT实验显示,转染hTERT基因的细胞在72 h后细胞增殖速率明显大于未转染细胞及空载体转染细胞.结果提示,过表达hTERT基因可提高血管内皮细胞端粒酶的活性和增殖能力.实验结果证明,端粒酶活性与细胞增殖活性密切相关.
- 林若芸黎丹戎钟艳平王琪李力
- 关键词：人端粒酶逆转录酶真核表达载体人脐静脉血管内皮细胞
