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陈小云: 作品数：100 被引量：199H指数：8; 供职机构：中国兽医药品监察所更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家重点实验室开放基金更多>>; 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>

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携带eGFP基因的重组牛结节性皮肤病病毒的构建及其生长特性研究: 2024年; 【目的】筛选可高效率表达重组牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)的不同启动子/细胞组合,据此构建携带增强绿色荧光蛋白(eGFP)基因的重组LSDV,并探究其生长特性,为后续抗病毒药物的开发以及病毒复制和作用机制的研究奠定基础。【方法】利用融合PCR方法分别将羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)启动子、LSDV启动子与eGFP基因进行连接,用以替换LSDV 005基因,构建同源重组片段,并将其分别转染至感染LSDV的非洲绿猴肾细胞(Vero)、非洲绿猴肾细胞衍生株(Vero-E6)、牛肾细胞(MDBK)、仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)、羊睾丸细胞(LT)和原代羊睾丸细胞(PLT)6种细胞中,通过荧光显微镜观察转染效果,并使用ImageJ软件统计荧光面积百分比,筛选出最优启动子/细胞组合。以筛选出的最优组合进行重组病毒转染,并检测病毒纯化效果,进一步探究重组病毒的生长特性和稳定性。【结果】在6种细胞中LSDV启动子的转染效果均优于ORFV启动子,且在PLT细胞中,LSDV启动子的荧光面积百分比最高(8.38%),与其他组细胞相比差异显著(P<0.05)。使用LSDV启动子/PLT细胞组合构建重组病毒LSDV-Δ005/eGFP,纯化后在倒置荧光显微镜下观察到所有病变部位均带有绿色荧光,荧光面积百分比约为50.8%。病毒的生长特性和稳定性分析结果显示,重组病毒LSDV-Δ005/eGFP在6种细胞中的病变效应以及病毒滴度随时间变化的趋势与野生毒株LSDV/Heilongjiang/2022相似,且在PLT细胞上连续传代10次eGFP基因稳定表达。【结论】利用LSDV启动子/PLT细胞组合构建重组LSDV时效率最佳,据此构建的重组病毒LSDV-Δ005/eGFP生长特性与LSDV野生毒株一致,经10次传代后遗传稳定性良好。; 莘若兰周祉玉张嘉雯杜吉革印春生王凤雪陈小云温永俊朱真; 关键词：细胞转染重组病毒

一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法: 本发明涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。本发明制备的产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有3个氨基酸突变的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空...; 陈小云杜吉革朱真薛麒王磊印春生李启红康凯姚文生; 文献传递

重组产气荚膜梭菌ε毒素三点突变体的融合表达及其免疫活性分析被引量：8: 2018年; 为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNETXm3。随后,将该基因片段克隆至原核表达载体p ET30a-(+),转染BL21(DE3)菌诱导表达、纯化,从而获得重组蛋白,进而利用Western blot方法检测重组蛋白与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)及小鼠的毒力。最后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果显示,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,且能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;100μg/m L的重组蛋白未显示细胞毒性;6.25 mg/kg剂量的重组蛋白对小鼠无致死性;每毫升的一免抗血清可中和80~120个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和750~1100个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。试验表明,产气荚膜梭菌ETX三点突变体的毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。; 杜吉革张秀坤朱真薛麒李启红印春生彭小兵王磊姚文生康凯陈小云; 关键词：突变体鞭毛蛋白抗原性

重组犬IFN-α的原核表达及抗病毒活性研究: 2024年; 本试验旨在建立犬α干扰素(CaIFN-α)原核表达及纯化方法,并对其抗病毒活性进行研究。通过构建pET-28a/CaIFN-α表达载体,高效表达和纯化rCaIFN-α;采用CCK-8法在犬肾细胞(MDCK)上测定rCaIFN-α的细胞毒性,在MDCK/VSV系统中测定其抗病毒活性效价;RT-qPCR检测rCaIFN-α作用MDCK细胞后下游ISGs的表达水平;进一步利用TCID 50和间接免疫荧光(IFA)测定rCaIFN-α抗犬副流感病毒(CPIV)和犬瘟热病毒(CDV)的感染能力。电泳和Western-blot结果显示,成功制备原核表达的特异性rCaIFN-α;CCK-8结果显示重组蛋白无明显细胞毒性,细胞病变抑制法测定抗VSV病毒活性效价为1.39×107 U/mL;RT-qPCR显示rCaIFN-α可显著上调ISG15、Mxl等ISGs的转录水平;IFA等结果显示,rCaIFN-α对CPIV和CDV具有良好的抗病毒作用。结果表明,本试验制备的rCaIFN-α具有优良的抗病毒感染活性,为进一步研发新型宠物抗病毒制剂奠定了基础。; 李乐琴曹众达李海珠杜吉革朱真陈小云罗玉峰胡仕凤印春生; 关键词：原核表达抗病毒活性

一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用: 本发明涉及一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗及其应用，本发明制备的无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种，系重组表达经过密码子优化的气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素A重组融合蛋白的大肠杆菌，用该菌种生产的气肿疽梭菌基因...; 杜吉革陈小云刘莹彭小兵薛麒朱真李启红印春生姚文生康凯; 文献传递

产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达及免疫保护力评价被引量：8: 2019年; 对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56和130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcpam4。将Gcpam4克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPAm4。利用Western blot方法检测rCPAm4与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测纯化蛋白的毒力。随后,将rCPAm4与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例混合乳化制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后21d,对家兔通过耳缘静脉注射1个家兔MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rCPAm4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPAm4主要以包涵体的形式表达,且能与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清反应;小鼠安全性试验显示,5.5mg/kg剂量的rCPAm4对小鼠仍无致死性;免疫rCPAm4后,每毫升的一免抗血清可中和10～20个小鼠MLD、二免抗血清可中和30～50个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%死亡,免疫组家兔得到了100%的保护。以上结果表明,rCPAm4具有良好的安全性和免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。; 杜吉革薛麒朱真李启红印春生姚文生康凯陈小云; 关键词：突变毒力抗原性

一种诺维梭菌α毒素的ELISA检测方法及应用: 本发明涉及诺维梭菌α毒素的ELISA检测试剂，利用灭活的诺维梭菌天然毒素作为免疫原免疫小鼠，采用经过原核表达系统获得的无毒性的、含有诺维梭菌α毒素N端的3个无毒性抗原肽和C末端的重组融合蛋白(rTncα)进行α毒素单克隆...; 刘莹杜吉革陈小云印春生李倩琳王磊杨承槐; 文献传递

端粒酶在细胞永生化中的应用被引量：4: 2013年; 细胞永生化是目前细胞生物学研究的热点和难点之一。位于真核生物细胞染色体末端的端粒可以稳定染色体,而由RNA和蛋白质组成的端粒酶以自身RNA为模板合成端粒。因此,将外源性端粒酶逆转录酶(TERT)基因转染至目的细胞,则可能诱导细胞发生永生化。本文从端粒、端粒酶、端粒酶在细胞永生化中的应用、端粒酶在传代细胞系中的应用、存在问题与展望等五个方面进行了综述,以期为相关研究人员提供参考。; 陈小云张敏王磊张启龙王栋蒋桃珍; 关键词：端粒酶细胞永生化

一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法: 本发明专利制备的腐败梭菌CSA基因工程疫苗，系采用经过密码子优化的，在含有4个氨基酸突变(C54L，N264A，H269A和W310A)的基础上缺失了11个氨基酸(第212位～第222位)的重组腐败梭菌CSA(rCSA<...; 杜吉革陈小云薛麒朱真李启红印春生康凯姚文生; 文献传递

腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价被引量：3: 2018年; 本研究旨在获得腐败梭菌OL毒素（CSa）的重组突变体，并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌OL毒素编码基因进行优化设计，同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变，经人工合成获得基因片段Gcsam4。将Gcsam4克隆至原核表达载体pET-30（＋）中进行表达与纯化，获得重组蛋白rcsam4。利用Western—blot检测rcsam4与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性，并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后，将rcsam4与Montanide ISA206佐剂以1：1（v／V）的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔，按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素，来检测rCSam4对家兔的免疫保护效果。结果表明。rcsam4主要以包涵体的形式存在，且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示，9．85μg／mL的蛋白仍无细胞毒性：小鼠安全性试验显示，5．5×10^3μg／kg的剂量对小鼠无致死性；免疫rcsam4后，每毫升的一免兔血清可中和50~70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；每毫升的二免兔血清可中和110～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；1个家免MLD的腐败梭菌毒素攻毒后，对照组家兔全部死亡，免疫组家免得到了100％（4／4）的保护。以上结果表明，rcsam4在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。; 杜吉革薛麒朱真李启红印春生彭小兵姚文生康凯陈小云; 关键词：突变毒性抗原性

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