林静
- 作品数：10 被引量：14H指数：2
- 供职机构：第三军医大学大坪医院野战外科研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 质粒表达型siRNA对人近端肾小管上皮细胞cubilin表达的抑制作用被引量：1
- 2007年
- 目的观察cubilinsiRNA真核表达载体对人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cell line,HKC)cubilin基因的特异性抑制作用。方法针对人cubilin基因设计并构建siRNA真核表达载体pSUPER EGFP-C1和pSUPER EGFP-C2,转染HKC,经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测cubilin mRNA的表达、不同浓度的人血清白蛋白(HSA)刺激正常HKC及转染重组质粒的HKC24h后cubilin mRNA的表达,并通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察HKC对白蛋白摄取情况的变化。结果FQ-PCR显示HSA刺激正常HKC后cubilin mRNA表达具有剂量依赖性。与正常对照组相比,两个重组质粒均可部分抑制HKC cubilin表达,抑制效率分别为66%和37%,HSA刺激转染pSUPER EGFP-C1、pSU-PER EGFP-C2的HKC后cubiin mRNA水平较正常对照组比较分别下降50%、34%,转染了重组质粒的HKC对白蛋白的摄取明显减少。结论成功地构建了针对人cubilin基因的RNA干扰真核表达载体,表达型siRNA可抑制肾小管上皮细胞cubilin基因的表达及对白蛋白的摄取。
- 林静何娅妮杨聚荣李新伦梁海君吴劲松李开龙丁涵露张建国
- 关键词：CUBILINRNA干扰SIRNA人近端肾小管上皮细胞
- 腺病毒介导Cubilin反义RNA对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的抑制作用被引量：2
- 2006年
- 目的构建细菌内同源重组型的Cub ilin反义RNA腺病毒表达载体并研究其对肾小管上皮细胞Cub ilin蛋白诱导表达的影响。方法PCR扩增大鼠Cub ilin起始编码区767 bp的DNA片段,与T载体连接,测序鉴定连接方向,通过选择反向和同向的双酶切位点与腺病毒穿梭载体pAdtack-CMV同时酶切和连接,构建反向插入(正向插入作为对照)的腺病毒穿梭载体。将Pm eⅠ线性化的腺病毒穿梭载体pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB转染包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的受体菌B J5183(AdEasyTMXL)进行同源重组。用含有卡那霉素的LB平板筛选同源重组阳性的克隆,PacⅠ酶切和测序鉴定后,转染包装细胞(293细胞),经病毒扩增和纯化后,再以OD法和GFP法计算重组腺病毒的滴度。经免疫印迹法分析Cub ilin反义RNA对Cub ilin蛋白质诱导表达的抑制作用。结果成功构建了Cub ilin的反义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-ACUB)和对照正义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-CUB),滴度为2.0×1010pfu/m l、1.8×1010pfu/m l;Cub ilin反义RNA腺病毒表达载体转染可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞的Cub ilin蛋白的诱导表达。结论Cub ilin的反义RNA腺病毒表达载体的成功构建以及对肾小管上皮细胞Cub ilin蛋白诱导表达的明显抑制作用,为在基因水平的研究和治疗蛋白尿引起的肾间质损伤奠定了良好的基础。
- 梁海君何娅妮杨聚荣丁涵露李开龙张建国李新伦林静刘俊
- 关键词：CUBILIN腺病毒反义RNA肾小管上皮细胞
- 腹腔镜直肠癌根治性切除术对中性粒细胞呼吸暴发功能的影响被引量：2
- 2005年
- 目的 探讨腹腔镜及开腹手术后,二者中性粒细胞呼吸暴发(respiratoryburst)功能的变化,了解腹腔镜手术对中性粒细胞杀菌功能的影响。方法 选取“直肠恶性肿瘤”患者2 0例,随机分为两组各10例,腹腔镜组(Laparoscopy)行经腹腔镜直肠癌根治性切除术,开腹组(Open)行开腹直肠癌根治性切除术作为对照。于术前、术后即刻、术后2 4h及72h ,抽取外周静脉血,行血常规检查,并分离中性粒细胞,经佛波酯(PMA)刺激后,用流式细胞仪检测呼吸暴发强度。结果 腹腔镜直肠癌根治性切除术后,患者白细胞总数及中性粒细胞升高幅度及呼吸暴发强度在术后2 4及72h明显低于开腹直肠癌根治性切除术后(P <0 0 5 )。结论 腹腔镜直肠癌根治性切除术后,中性粒细胞杀菌功能低于开腹直肠癌根治性切除术后。
- 吴劲松刘宝华刘韧张连阳林静
- 关键词：腹腔镜直肠癌根治术中性粒细胞
- 人NaDC1基因启动子序列转录调控元件的初步分析
- 2007年
- 目的对hNaDC1基因启动子序列转录调控元件进行初步分析。方法构建hNaDC1基因5′侧翼序列系列缺失质粒,以双荧光素酶报告基因检测系统检测hNaDC1基因5′侧翼区(-2232/+136)的转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性最高,为(2.98±0.45);pGL3-hNaDC1D的转录活性最低,为(0.45±0.14)。以pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性为基准(100%),其他4种质粒相应的转录活性分别为:pGL3-hNaDC1B86.7%,pGL3-hNaDC1C89.4%,pGL3-hNaDC1D15.8%,pGL3-hNaDC1E61.2%。MatInspector5.0软件预测结果显示hNaDC1基因5′侧翼启动子序列共含有22个14种转录因子结合位点。结论hNaDC1基因5′侧翼区-1084/-254和-12/+136区域可能存在有正性作用转录因子的结合位点。
- 杨聚荣何娅妮张剑凯李新伦梁海君林静吴小玮王惠明李开龙
- 关键词：转录调控
- 人NaDC1基因近端启动子生物信息学分析及载体构建被引量：3
- 2007年
- 目的对人NaDC1(hNaDC1)基因近端启动子进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式元件,并构建相应基因序列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法使用First EF程序分析并获得hNaDC1基因近端启动子序列,使用MatInspector5.0软件对近端启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。PCR法扩增hNaDC1基因近端启动子序列,PCR产物经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆到pGL3-Basic载体。重组质粒行KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定。结果使用FirstEF程序获得长度为2.4kb(-2232/+136)的hNaDC1基因近端启动子序列。MatInspector5.0程序分析显示该基因序列共含有152个74种顺式作用元件。KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hNaDC1A质粒插入片段正确无误。结论成功构建hNaDC1基因近端启动子转录调控序列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为利用双荧光素酶报告基因检测系统研究hNaDC1基因近端启动子转录调控元件的分布及其性质提供了基本试验条件。
- 杨聚荣张剑凯何娅妮李新伦梁海君林静
- 关键词：转录调控报告基因
- 人cubilin蛋白功能片段原核表达系统的建立被引量：2
- 2006年
- 目的构建编码白蛋白吞饮受体人cubilin(hcubilin)蛋白配体结合域CUB78基因片段的原核表达载体,诱导表达并鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pGEX hCUB78,IPTG诱导表达,SDS PAGE与免疫印迹法鉴定表达产物,Pulldown实验验证融合蛋白是否与白蛋白结合。结果双酶切和测序鉴定表明CUB78片段插入正确,诱导表达后获得分子量为52×103的融合蛋白,该融合蛋白可以被抗GST抗体识别,并且可以和白蛋白结合。结论CUB78基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,并且可以和白蛋白结合,这为进一步研究该功能域的结构与功能奠定了基础。
- 李新伦何娅妮杨聚荣梁海君林静李开龙丁涵露张建国
- 关键词：CUBILINPGEX-4T-1融合蛋白白蛋白
- Cubilin白蛋白结合域重要功能残基的研究
- 目的Cubilin是肾近曲小管上皮细胞负责重吸收白蛋白等大分子物质的吞饮受体,研究发现其在蛋白尿相关性肾损害中具有重要作用。本研究结合生物性信息学、基因工程以及生物传感器技术对cubilin白蛋白结合域重要氨基酸残基进行...
- 杨聚荣何娅妮李新伦梁海君林静吴小玮
- 关键词：白蛋白结合域CUBILIN
- 文献传递
- 白蛋白活化肾小管上皮细胞对肾小管周微血管的影响及机制研究
- 2008年
- 目的探讨人类血清白蛋白（HSA）超负荷损伤肾小管上皮细胞后对肾间质微血管损伤的影响及可能机制。方法激光共聚焦显微镜观察肾小管上皮细胞（HKC）吞饮罗丹明标记白蛋白（TRITC—BSA）以及吞饮受体cubilin siRNA对其的抑制效应。氢化乙锭标记的荧光探针柃测白蛋白刺激HKC产生O2^-以及白蛋白乔饮受体cubilin siRNA和线粒体呼吸链复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮对HKC产生O2^-的抑制作用。培养上清H2O2采用化学比色方法检测。倒置显微镜下观察HSA激活的HKC以及cubilin siRNA或龟藤酮预处理的HKC与脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养后缸管内皮管样结构形成情况。四甲基偶氮哗盐（MTT）比色法测定内皮细胞活力。用流式细胞仪以AnnexinV FITC／PI双染法偷测内皮细胞凋亡率。结果（1）cubilin siRNA可显著抑制HKC译饮白蛋白（P〈0．05）。（2）HSA刺激HKC产生ROS呈剂量及时间依赖性（P〈0．05）；cubilin siRNA及鱼藤酮均可抑制门蛋门超负荷诱导HKC产牛大垃ROS（P〈0．05）。（3）HKC与HUVEC共培养体系中，HSA活化的HKC抑制内皮细胞管样结构的形成，内皮细胞增殖显著减少（P〈0．05），细胞凋亡率显著增高（P〈0．05）；而cubilin siRNA和鱼藤酮干预组内皮细胞管样结构数及内皮细胞活力显著增加（P〈0．05），细胞凋亡率显著降低（P〈0．05）。结论白蛋白可通过乔饮受体cubilin激活肾小管上皮细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ产生大馈ROS，后者可能是慢性肾病时大量蛋白尿活化肾小管上皮细胞进而损伤肾小管周徽血管网的再要介质。
- 林静何娅妮王惠明李开龙丁涵露申海鹰杨聚荣
- 关键词：肾小管上皮细胞内皮细胞白蛋白活性氧
- 人cubilin蛋白与其配体白蛋白结合特定结构域的预测
- 2007年
- 目的同源模建cub8功能域的三维模型,并以计算机辅助的分子对接方法预测cub8功能域与白蛋白的候选结合氨基酸残基。方法采用insightⅡ工作站对cub8蛋白进行同源模建,对cub8蛋白和白蛋白进行分子对接,寻找白蛋白和cub8的候选结合氨基酸残基。结果cub8蛋白三维结构为两个反平行的β片层结构,中间以β转角相连。cub8蛋白片段与白蛋白通过正负电势的吸引完成受体与配体的结合。Asp59-Tyr60-Leu61-Glu62-Leu63-Tyr64和Arg72-Tyr73肽段可能是cubilin与白蛋白结合的关键氨基酸残基。结论利用计算机辅助的分子对接技术,获得cub8和白蛋白相互作用的两个候选结合域,为进一步研究cubilin与白蛋白相互作用奠定基础。
- 杨聚荣何娅妮李新伦梁海君林静吴小玮
- 关键词：同源模建白蛋白
- 378例单纯性肾囊肿患者肾功能变化的病例对照研究被引量：5
- 2005年
- 目的本文通过病例对照研究探讨单纯性肾囊肿患者肾功能的变化及其可能机理.方法采用病例对照研究方法对我院2000年1月～2004年12月在院确诊为单纯性肾囊肿病人的年龄、性别、身高、体重、血压、尿常规、血肌酐等指标进行统计学分析.结果与对照组比较,单纯性肾囊肿组血肌酐值显著增高,eGFR显著降低,SBP、DBP显著升高;尿白细胞及红细胞的发生率显著增高.肾囊肿容量与eGFR呈负相关(r=-0.17,P＜0.05),但与血肌酐、SBP及DBP间无相关性.单纯性肾囊肿患者肾结石发生率为18.3%(69/378),显著高于对照组.多因素logistic回归分析结果显示年龄、SBP、肾囊肿容量、白细胞尿及肾结石是单纯性肾囊肿患者eGFR下降的危险因素.结论单纯性肾囊肿患者肾功能呈下降趋势,常伴高水平的血压值,易合并泌尿系感染、肾结石等疾病,这可能与其肾功能损害有关.
- 杨聚荣何娅妮李新伦梁海君林静周源张建国李开龙丁涵露王惠民
- 关键词：单纯性肾囊肿EGFR
